柚皮苷纳米纤维膜载药量影响成骨细胞的增殖和分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.003

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (25): 4577-4584.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.003

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柚皮苷纳米纤维膜载药量影响成骨细胞的增殖和分化

纪艳，王璐，游涛，吴小红

重庆医科大学附属口腔医院修复科，口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市 401147

收稿日期:2013-01-11 修回日期:2013-01-25 出版日期:2013-06-18 发布日期:2013-06-18
通讯作者: 吴小红，主治医师，博士，重庆医科大学附属口腔医院修复科,口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市 401147 hiwxh@hotmail.com
作者简介:纪艳★，女，1983年生，重庆市人，汉族，重庆医科大学在读硕士，医师，主要从事组织工程骨材料研究。 14067583@qq.com
基金资助:
重庆市科委(部省级面上项目)课题：控释柚皮苷纳米纤维膜修复骨质疏松状态下的骨临界缺损的研究(CSTC,2010BB5102)；重庆市医科大学校级课题(国家自然科学基金预研项目)：柚皮苷对骨质疏松状态下颅颌面骨缺损修复的机理研究(NSFYY201045)；重庆医科大学附属口腔医院院级课题：控释中药的诱导骨再生膜的研制。

Drug loading of naringin nanofibrous membrane influences osteoblast proliferation and differentiation

Ji Yan, Wang Lu, You Tao, Wu Xiao-hong

Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory for Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China

Received:2013-01-11 Revised:2013-01-25 Online:2013-06-18 Published:2013-06-18
Contact: Wu Xiao-hong, M.D., Attending physician, Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory for Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China hiwxh@hotmail.com
About author:Ji Yan★, Studying for master’s degree, Physician, Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory for Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China 14067583@qq.com
Supported by:
the General Program of Chongqing Science and Technology Committee, No. CSTC, 2010BB5102; the Project of Chongqing Medical University (Pre-research Project of the National Natural Science Foundation of China), No. NSFYY201045; grants from the Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University

摘要/Abstract

摘要：

背景：多数研究认为，单纯的引导性骨再生膜只是起到了机械性阻挡和隔离作用，不具备主动诱导作用。大量研究显示柚皮苷可促进多种成骨样细胞的增殖和分化。
目的：制备载有柚皮苷的引导性骨再生膜，并研究一定电纺参数下的最佳载药剂量。
方法：以聚己内酯与聚乙二醇-b-聚己内酯为材料，通过静电纺丝技术制备含0(对照)，0.1，1，10，100 g/L柚皮苷的纳米纤维膜，扫描电镜观察膜的表面形态。将MC3T3-E1成骨细胞接种于含不同质量浓度柚皮苷的纳米纤维膜上，以扫描电镜观察细胞/膜复合体的表面形态，以噻唑蓝法检测细胞的增殖能力，以碱性磷酸酶活性检测评估细胞的分化能力。
结果与结论：当柚皮苷质量浓度为0.1，1，10 g/L时，纳米纤维表明光滑，直径均一，呈纵横交错的三维网状结构。当柚皮苷质量浓度100 g/L时，纳米纤维膜表面有较多膨大的珠状结构，直径均一性较差。与对照组比较，含10 g/L柚皮苷的纳米纤维膜能显著促进成骨细胞的增殖(P < 0.05)；含1，10 g/L柚皮苷的纳米纤维膜均能显著促进成骨细胞的碱性磷酸酶活性(P < 0.05)，并且以含10 g/L柚皮苷的纳米纤维膜组作用最明显。表明载柚皮苷的引导性骨再生纳米纤维膜能促进成骨细胞的增殖和分化，10 g/L为柚皮苷的最佳载药剂量。

关键词: 生物材料, 组织工程骨材料, 纳米材料, 电纺, 柚皮苷, 纳米纤维膜, 载药, 成骨细胞, 增殖, 分化, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Guided bone regeneration membrane just plays a mechanical barrier and isolation effect, but cannot exert an active induction role. Numerous studies have shown that naringin can promote the proliferation and differentiation of a variety of osteoblast-like cells.
OBJECTIVE: To prepare the guided bone regeneration membranes carrying naringin and to design the optimal drug loading of the membrane.
METHODS: Nanofibrous membranes containing different contents of naringin (0, 0.1, 1, 10, 100 g/L) were prepared by electrospinning. The morphologies of the membranes were observed by scanning electron microscope. MC3T3-E1 osteoblasts were seeded on the membranes. The morphologies of the cell-membrane composites were observed by scanning electron microscope. The cell proliferation was tested by methyl thiazolyl tetrazolium assay and the cell differentiation was evaluated by alkaline phosphatase activity.
RESULTS AND CONCLUSION: Smooth and uniform nanofibers were obtained by electrospinning with drug loading of 0.1, 1, 10 g/L naringin. There were no significant differences among the diameters of these three kinds of nanofibers. Many beads were observed in the nanofibrous membrane containing 100 g/L naringin. The results of methyl thiazolyl tetrazolium assay and alkaline phosphatase activity showed, as compared with the control group (containing 0 g/L naringin), the nanofibrous membrane containing 10 g/L naringin significantly promoted cell proliferation and differentiation (P < 0.05), while that containing 1 and 10 g/L naringin significantly increased alkaline phosphatase activity in osteoblasts (P < 0.05). The electrospinning naringin nanofibrous membrane with the optimal drug loading of 10 g/L promoted osteoblast proliferation and differentiation most significantly. Therefore, this new type of guided bone regeneration membranes will have a wonderful prospect in repair of bone defect under the state of osteoporosis.

Key words: biomaterials, tissue-engineered bone materials, nanomaterials, electrospinning, naringin, nanofibrous membranes, drug-loading, osteoblasts, proliferation, differentiation, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

纪艳，王璐，游涛，吴小红. 柚皮苷纳米纤维膜载药量影响成骨细胞的增殖和分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(25): 4577-4584.

Ji Yan, Wang Lu, You Tao, Wu Xiao-hong. Drug loading of naringin nanofibrous membrane influences osteoblast proliferation and differentiation [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(25): 4577-4584.

图/表（结果） 4

2.1 柚皮苷纳米纤维表面形态观察 图1显示了各组电纺柚皮苷纳米纤维膜的扫描电镜照片，含柚皮苷0.1，1，10 g/L的纤维表面光滑，直径均一，纤维呈纵横交错的三维网状结构，见图1A-C；柚皮苷含量为100 g/L的纤维表面有较多膨大的珠状结构，直径均一性较差，见图1D。

经图像分析软件统计，含柚皮苷0.1，1，10，100 g/L的纤维平均直径分别为(234±31)，(248±44)，(253±48)，(262±67) nm。在一定的电纺过程参数下，随柚皮苷含量的增加，纤维直径略有增大，但各组直径比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.2 成骨细胞细胞与纳米纤维膜共培养的细胞形态观察 扫描电镜下示MC3T3-E1成骨细胞在各组纳米纤维膜上均黏附生长，呈不规则的多边形，伪足伸展充分。0，0.1 g/L组细胞数量较少，可见电纺纳米纤维相互交错的多孔网状结构，见图2A。1，10 g/L组由于细胞大量增殖，纤维膜表面完全被多层细胞和/或细胞外基质覆盖，细胞和细胞外基质与纳米纤维构成相互交联的网络，见图2B，C。因100 g/L组纤维表面颗粒多且粗大，不利于细胞的黏附与铺展，见图2D，则不参与以下的细胞学实验。

2.3 MTT法测定柚皮苷纳米纤维膜对成骨细胞增殖的影响 共培养1，3，5 d后，各组的吸光度值A_{490 nm}均随培养时间的增加而增大。10 g/L组1，3，5 d吸光度值与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；1 g/L组在 5 d吸光度值与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；0.1 g/L组在各时间点吸光度值与对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.4 碱性磷酸酶活性测定柚皮苷纳米纤维膜对成骨细胞分化的影响 见图4。

共培养4，7，10 d后，各组的吸光度值A_{410 nm}均随培养时间的增加而增大。与对照组比较，1，10 g/L组在各个时间点均可促进成骨细胞的碱性磷酸酶活性 (P < 0.05)，其中以10 g/L组的促进作用最明显 (P < 0.01)。0.1 g/L组在各时间点的吸光度值与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

中国是世界上老年人口数量最多的国家，随着人口的日益老龄化，老年性疾病，特别是骨质疏松症的发病率也在同步增长。作为全身骨骼的一部分，口腔颌面部也受到骨质疏松的影响。口腔颅颌面部的骨缺损是由肿瘤、炎症、创伤、发育异常等原因造成的常见病，大的缺损需要用骨修复材料进行重建。然而骨质疏松会减弱材料与骨的结合能力，延缓骨缺损的修复，降低新骨形成的质量，甚至导致修复失败^[1]。因此，骨质疏松状态下的口腔颅颌面部骨缺损修复是目前国际上口腔临床医学亟待解决的难题。

生理状态下骨的形成和吸收保持着动态平衡。一方面成骨细胞不断合成分泌骨基质，随后基质矿化，形成新骨；另一方面破骨细胞不断地吸收旧骨。骨质疏松症就是由于骨的自稳态失衡，破骨量大于成骨量所致。因此，纠正失衡，增加成骨或减少骨吸收是治疗骨质疏松的重要方法。中医药资源是中国的国宝之一，在骨科中的应用有很长的历史，其中骨碎补是使用频率较高的药物。中医认为骨碎补有补肾强骨、促进骨折愈合、续伤阵痛等功效，适用于牙齿松动、跌打闪挫、筋骨折伤、骨质疏松等症^[2]。柚皮苷是中药骨碎补的主要活性物质。大量研究证实，柚皮苷能促进成骨细胞系的增殖和分化^[3-4]，诱导成骨细胞骨形成蛋白2的表达^[5]，同时抑制破骨细胞的形成^[6]。

综上所述，柚皮苷能够增加成骨和减少骨吸收，维持骨代谢的动态平衡，是预防和治疗骨质疏松的有效药物。此外中国拥有丰富的柚皮苷资源，其还大量存在于芸香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，提取工艺相对简单，易于储存。

引导性骨再生技术是随着细胞生物学和生物医学工程的不断发展而诞生的，它为骨缺损的治疗开辟了一个新的领域。引导性骨再生的机制是利用修复过程中不同组织细胞向骨缺损内生长的速度不一样，用膜形成机械性屏障，阻碍周围组织长入骨缺损区，使骨细胞在缺损区内生长修复。在引导性骨再生技术中膜材料是关键。其中可降解性膜材料具有可被组织吸收、不需要二次手术取出的优点，因此在实际应用中多数学者倾向于是用可降解性膜材料。近年来，利用静电纺丝技术制备的聚合物纳米纤维膜具有高孔隙率、高比表面积的特点，类似于细胞外基质的形态和结构，利于蛋白在其表面吸附，从而促进成骨细胞的黏附、铺展、细胞外基质的生成和矿化^[7]，已被广泛应用于骨、肌腱、血管和神经等组织的修复^[8-12]。

课题将骨碎补的主要活性物质柚皮苷与静电纺纳米纤维技术相结合，制备出控释柚皮苷纳米纤维膜，为骨质疏松状态下的颅颌面骨缺损修复提供新材料。前期体外实验已验证制备的电纺柚皮苷纳米纤维膜具有合适的机械性能，药物随材料降解持续缓慢释放，同时能促进成骨细胞的增殖和分化。实验拟进一步检测不同载药量柚皮苷纳米纤维膜的微观形态，以及其对MC3T3-E1成骨细胞增殖和分化的影响，为载药引导性骨再生膜材料的研究提供可靠的实验数据。

材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2011年11月至2012年5月在重庆医科大学附属口腔医院实验室及重庆大学生物工程学院实验室完成。

材料：

柚皮苷纳米纤维膜载药量对成骨细胞增殖和分化影响实验的主要材料：聚己内酯(M_w=80 000)、聚乙二醇-b-聚己内酯(聚乙二醇M_w=5 000；聚己内酯M_w=5 000)、噻唑蓝(MTT)试剂盒(Sigma，美国)；柚皮苷(纯度>99%)、DMEM培养液、胎牛血清(Gibco，美国)；0.25%胰蛋白酶(华北制药集团)；二甲亚砜(上海东风试剂厂)；碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；MC3T3-E1成骨细胞株(重庆医科大学生命科学院)；高压直流电源(Gamma高压研究所，美国)；JSM-5600LV型扫描电镜(Jeol，日本)；图像分析软件Image-ProPlus 5.02(美国Media Cybernetics公司)；酶标仪(Bio-Tek，美国)。

实验方法：

电纺制备柚皮苷纳米纤维膜：将聚己内酯与聚乙二醇- b-聚己内酯1∶1混合溶于丙酮，配制成150 g/L的聚己内酯/聚乙二醇-b-聚己内酯溶液。再将柚皮苷溶于聚己内酯/聚乙二醇-b-聚己内酯混合溶液中得到终质量浓度为0.1，1，10，100 g/L的电纺丝溶液。将制备好的电纺丝溶液在室温下充分搅动1 h后，加入装有21号不锈钢钝性针头的5 mL注射器，针头与高压直流电源的正极相连，针头下方安装一个接地的铜板，上覆铝箔作为纤维的接收屏(10 cm×10 cm)与高压直流电源的负极相连。电纺参数为：电压15 kV，接收距离12 cm，溶液流量3 mL/h，每张膜电纺时间20 min。收集接收屏表面获得的无序排列的纳米纤维膜，置于干燥器中干燥保存。

扫描电镜观察柚皮苷纳米纤维膜的表面形态：将所制备的电纺纤维膜固定在样品台上，旋转蒸镀仪喷金，使用扫描电镜进行观察，电子加速度为30 kV。采用图像分析软件Image-ProPlus 5.02测定电镜照片中的纤维直径，每张照片至少选取20根纤维，每根纤维至少5个断面，计算直径平均值。

MC3T3-E1成骨细胞的接种与培养：将电纺柚皮苷纳米纤维膜裁剪成10 mm×10 mm大小，接种细胞前先将膜的正反两面分别用紫外光照射2 h，以PBS冲洗3遍，每遍20 min，铺于24孔板底，加入DMEM培养液过夜。以含0 g/L柚皮苷的聚己内酯/聚乙二醇-b-聚己内酯纳米纤维膜为对照组，柚皮苷含量0.1，1，10 g/L的聚己内酯/聚乙二醇-b-聚己内酯/柚皮苷纳米纤维膜为实验组。取生长良好的第3代MC3T3-E1成骨细胞培养在含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素及链霉素的DMEM培养液中，当细胞生长达80%时用胰蛋白酶消化离心，调整细胞浓度为2×10⁷L^-1，于24孔板每孔加1 mL细胞悬液，置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度的细胞培养箱中继续培养，每3 d更换1次培养液。

扫描电镜观察成骨细胞在柚皮苷纳米纤维膜上生长的形态：于细胞接种5 d后取出细胞/柚皮苷纳米纤维膜复合体，PBS冲洗3遍，室温下在2%戊二醛中固定1.5 h，乙醇梯度脱水，临界点干燥，离子溅射仪喷金，将所制备的细胞/柚皮苷纳米纤维膜复合体固定在样品台上，旋转蒸镀仪喷金，使用扫描电镜进行观察，电子加速度电压为20 kV。

噻唑蓝(MTT)法测定柚皮苷纳米纤维膜对成骨细胞增殖能力的影响：细胞接种后1，3，5 d，每孔加入5 g/L MTT 20 µL，继续孵育4 h，弃上清，PBS轻柔洗涤2次，加150 µL DMSO，振荡10 min，将实验组上清移入96孔板内，用酶标仪测其在490 nm处的吸光度值(A_490nm)，每个时间点每组检测6孔，重复测量3次，取平均值。

碱性磷酸酶活性检测柚皮苷纳米纤维膜对成骨细胞分化能力的影响：细胞接种后4，7，10 d，每孔加入0.25%胰蛋白酶消化3 min，然后加入含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素及链霉素的DMEM培养液终止消化，离心 10 min。每管加入200 µL细胞裂解液，充分吹打混合。转移至96孔板，加入体积分数0.01%Triton X-100 50 µL，4 ℃过夜。采用碱性磷酸酶检测试剂盒，每孔加入碱性磷酸酶100 µL，37 ℃孵育30 min。0.2 mol/L NaOH 50 µL终止反应，在酶标仪上测其在 410 nm处的吸光度值(A_{410 nm})，每个时间点每组检测6孔，重复测量3次，取平均值。

主要观察指标：柚皮苷纳米纤维膜的微观形态；柚皮苷纳米纤维膜上MC3T3-E1成骨细胞的微观形态及增殖和分化情况。

统计学分析：采用SPSS 11.0统计软件包进行分析。数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

自从引导性骨再生的概念提出以来，经过人们不断的探索，该技术已被广泛运用于口腔颅颌面部骨缺损的修复。引导性骨再生生物膜和植骨材料一直是研究的热点。理想的引导性骨再生膜应有可降解性，生物相容性好，高表面积体积比，成骨诱导性和合适的机械性能^[7]。近来由电纺丝技术制得的纤维可达到纳米级，且表面积大、孔隙率高，以及可改变尺寸和形状^[13]，具有细胞外基质的仿生潜能。这些特点赋予电纺技术制备的引导性骨再生纳米纤维膜在引导性骨组织再生领域中拥有广泛的应用前景。

然而随着人口老龄化，骨质疏松症的发病率日益增长。骨质疏松会加大骨缺损修复的难度。有学者认为单纯的引导性骨再生膜只是起到了机械性阻挡和隔离的作用，不具备主动诱导的作用^[14]，或是单纯膜材料的诱导能力弱，引导再生的骨量有限，不能满足临床要求^[15]。对于骨质疏松的患者，结合了抗骨质疏松药物的引导性骨再生膜在引导骨再生的同时主动纠正失衡，增加局部成骨或/和减少骨吸收，促进骨组织的修复。制备性能良好的引导性骨再生膜作为药物的载体，并控制其释放是目前这方面的研究重点之一。

柚皮苷是一种天然的黄酮类化合物，是中药骨碎补的主要活性成分。大量研究显示柚皮苷可促进多种成骨样细胞的增殖和分化，包括小鼠MC3T3-E1成骨细胞^{[5, 16]}、小鼠原代培养成骨细胞^[5]、人原代培养成骨细胞^[5]、人骨髓间充质干细胞,和UMR106骨肉瘤细胞^{[6, 17]}。柚皮苷还可下调成骨细胞中的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，而羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的下调能够增强骨形成蛋白2在成骨细胞中的表达和刺激骨生成^[16]。Wu等^[5]认为柚皮苷也能诱导骨形成蛋白2在成骨细胞中的表达和刺激成骨细胞生长。同时，柚皮苷能够通过阻止RANK因子介导的NF-kappaB和ERK信号，抑制破骨细胞关键基因的表达，干扰破骨细胞的形成和减少骨吸收^[18]。Hirata^[6]报道柚皮苷对由白细胞介素1诱导的破骨细胞形成有剂量依赖性抑制作用。此外，柚皮苷具有双向调节雌激素活性的功能，它们在体内雌激素缺乏的时候能够激活雌激素；而在体内雌激素过多时表现为抗雌激素的作用。这种双向调节的机制在于它们能够选择性的与雌激素受体β结合，从而预防和治疗骨质疏松^[19]。

综上所述，柚皮苷具有预防和治疗骨质疏松的作用。因此，将柚皮苷载入引导性骨再生膜中能增强骨质疏松状态下骨缺损部位的修复能力。实验采用可降解的聚合物聚己内酯作为静电纺丝的原材料，它具有无毒、价廉、易电纺成丝的特点，能为膜材料提供合适的机械性能和完整性^[20]。然而由于聚己内酯是疏水物质，而柚皮苷是水溶性药物，在静电纺丝过程中二者在溶剂挥发时会发生严重的相分离行为，因而大部分药物最后可能仅停留于纤维丝表面，其后果将使得药物具有较大的初始释放率和短的持续释放时间。为了有效控制药物的释放行为，让纳米纤维丝包裹部分药物，一种双亲性的嵌段聚合物-聚乙二醇-b-聚己内酯将被加入聚合物溶液，使纳米纤维丝能够包裹部分柚皮苷/聚乙二醇-b-聚己内酯复合物。

双亲嵌段聚合物是指在同一大分子中既含有亲水链段又含有疏水链段的聚合物。对于不相容聚合物共混体系，加入双亲嵌段聚合物是提高界面黏结力、改善共混物相容性的有效途径，有效减少体系相畴的尺寸至纳米或微米级，并使共混组分不相容的聚合物分子链近似呈分子链(或分子簇)之间的相互贯穿缠结，同时在加工过程中又能保持这种相互缠结的结构^[21]。Kim等^[22]报道，双亲嵌段聚合物能够将亲水药物载入电纺的聚合物纤维，并构成控释药物系统。在此基础上，实验进一步研究了柚皮苷不同载药量对电纺纤维膜表面形态，以及对成骨细胞增殖和分化的影响。

图1扫描电镜观察结果显示，柚皮苷含量为0.1，1，10 g/L的纤维表面光滑，直径均一。以上3组纤维的直径均位于天然细胞外基质50-500 nm的范围内^[23]，有利于蛋白在其表面吸附，进而促进成骨细胞的黏附、铺展、细胞外基质的生成和矿化^[24]。而柚皮苷含量为100 g/L的纤维表面有较多膨大的珠状结构，直径均一性较差，可能是因为药物浓度太大，聚乙二醇-b-聚己内酯的载荷能力有限，多余的柚皮苷未完全溶解于聚己内酯/聚乙二醇-b-聚己内酯混溶系统，在电纺过程中形成较多膨大的颗粒散在分布于纤维膜上。柚皮苷含量为100 g/L的纳米纤维膜由于颗粒较多，不利于细胞黏附，则未进行细胞学实验。

MC3T3-E1细胞株具有体外培养成骨细胞的各种生物学特性，已成为研究药物对成骨细胞影响有价值的体外细胞模型^[25]。由于作用于体外培养MC3T3-E1成骨细胞的药物都没有经过胃肠道过滤及选择性吸收等过程而直接起作用于细胞，故经过计算，在设定的电纺参数条件下，将纤维膜中的柚皮苷溶于细胞培养液中的质量浓度调整到100 mg/L以下，在此浓度范围内对细胞的毒性很小，几乎不影响细胞的生长^[26]。

实验用MTT法检测不同载药量的柚皮苷纳米纤维膜对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响。结果显示10 g/L组在各个时间点均能促进细胞增殖，而1 g/L组在5 d前无明显促进细胞增殖的作用，可能是因为聚乙二醇-b-聚己内酯加入构成的控释药物载体，使柚皮苷部分包裹于聚合物纤维中，随聚合物的降解缓慢持续释放，第1，3天，由于释放到培养液中的柚皮苷浓度极小，促进MC3T3-E1成骨细胞增殖的作用不明显，随时间延长，到第5天时柚皮苷在培养液中的浓度增大，较对照组能显著促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖。而0.1 g/L组因为药物浓度太小，促细胞增殖作用不明显。扫描电镜观察结果进一步表明1，10 g/L组在第5天由于细胞大量增殖，纤维膜表面完全被多层细胞和/或细胞外基质覆盖，其细胞增殖情况与MTT检测的结果相吻合。

碱性磷酸酶是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，特异性高，其在细胞中表达的多少能合理地反映成骨细胞的分化程度和功能状态，当成骨细胞活动增强时，碱性磷酸酶活性升高，碱性磷酸酶活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志^[27]。碱性磷酸酶检测结果表明1， 10 g/L组在各个时间点均能促进细胞分化，且碱性磷酸酶的活性与柚皮苷的浓度成正比。而0.1 g/L组因为药物浓度太小，促细胞分化作用不明显。说明在实验设定的电纺参数条件下，柚皮苷纳米纤维膜促进MC3T3-E1成骨细胞增殖和分化的最佳有效载药量为10 g/L。

实验表明将一定浓度的柚皮苷溶于聚己内酯和聚乙二醇-b-聚己内酯构成的混合溶液，经电纺制备出的柚皮苷纳米纤维膜可以提高MC3T3-E1成骨细胞的增殖和分化能力，作为一种新型的载药引导性骨再生膜或许能为骨质疏松状态下颅颌面骨缺损修复开辟一条新的道路。但由于骨代谢过程是成骨细胞和破骨细胞的共同作用，今后将继续建立作用于破骨细胞的实验模型，进一步探讨柚皮苷纳米纤维膜作用于破骨细胞的相关机制。

柚皮苷纳米纤维膜载药量影响成骨细胞的增殖和分化

Drug loading of naringin nanofibrous membrane influences osteoblast proliferation and differentiation

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